| |
|
| |
 |
CD(圓二色光譜儀)樣品的前處理 |
| |
 |
我們有一個很好的建議，那就是在測量CD以前先測量一般UV/VIS吸收光譜。CD光譜
的需求與UV/VIS一樣：在0.5-1.0吸收值範圍內的訊號會有最好訊雜比。通常樣品
與溶劑吸收值和大於2 O.D.時將會很困難得到正確的數據。
接著我們會面臨其他問題：
實際上在低波長UV掃描很困難得到正確吸收值。大部份現今光譜儀都限制在190nm
以上，因此任何一次低於200nm以下測定將會是個問題。所以通常會建議直接使用
CD光譜儀來做吸收光譜測量。
因為大部份溶劑及緩衝液在UV都有很強的吸收，而總吸收值對CD測定的結果會影
響，而這一點也必需考慮進去。
選擇合適的緩衝液
在CD測定時選擇合適的緩衝液是非常重要。緩衝液必需儘量「透明」。大部份有意
思的結構資訊被發現在低波長UV。這個波段也是一些緩衝液具有高吸收值會遮蔽CD
訊號。對大部分工作而言10mM 磷酸鉀是一個很好的選擇。我們可以用適當比例的
KH2PO4及K2HPO4混合達到我們想要的pH值。千萬不可以用HCl來調整pH。在低UV波
段氯離子會嚴重干擾CD測定。如果有需要輔助離子時不要使用NaCl，可以用Na2SO4
或NaF。
樣品的濃度
CD測量工作也是需要有正確的樣品濃度。如果您的樣品吸收值超過1.0以上時，是
明顯無法測得正確的CD。以下我們提供一個簡單的方法去得到樣品的正確濃度。這
個計算先從用於10mm液槽的莫耳濃度開始。
115/(分子量*7000)
如果是使用1mm液槽時乘以10倍。如果是使用0.1mm液槽時乘以100倍。而這求得的
濃度也許需要增加2倍或減少一半以便得到最好的訊雜比。(請參考：Methods for
Protein Analysis (1994) R. A. Copeland, Chapman and Hall,New York, p.
194)。而且在測量CD以前先用UV掃描測量波段下溶劑及樣品的吸收是否會造成問題
是很值得的。
液槽光徑
選擇合適光徑的CD液槽對於解決溶劑吸收問題將會非常有幫助。小一點光徑(如：
0.1mm或0.05mm)液槽可以明顯降低溶劑吸收並且可容許掃瞄到低波長。而這些液槽
必需使用較高濃度的蛋白質，如約1mg/ml。
過濾
將樣品通過0.2um或0.45um過濾可去除影響CD測量的灰塵、凝集的蛋白質及其他粒
子。 |
| |
| |
|
| |
| [回上一頁] |
|
